去糖牛奶的制備方法
一種從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白的方法 背景技術(shù)
本發(fā)明涉及一種用攪拌罐同時(shí)從牛奶或乳清水中提取高純度的乳鐵蛋白
(bovine lactoferrin, 縮寫(xiě)為BLF)、氧化酶蛋白(bovine lactoperoxidase， 縮寫(xiě)為BLP)以及乳鐵蛋白和氧化酶蛋白混合物的方法。氧化酶蛋白和乳鐵蛋白 有著(zhù)廣譜的抗菌，抗病毒及提高機體抗病的免疫功能。例如BLP能夠破壞病菌的 細胞質(zhì)，抑制病菌生長(cháng)過(guò)程中的核糖核酸的合成。因而其對革蘭氏陽(yáng)性菌及革 蘭氏陰性菌，酵母如白色念珠菌，以及霉菌如黑曲霉菌都有抑制作用。哺乳類(lèi) 動(dòng)物中的分泌物中存在氧化酶蛋白，特別是乳汁中。但其濃度在初乳中很低， 4-5天后其濃度迅速增加作為母體傳給初生兒的抗菌素。因為初生兒的免疫糸統
尚未發(fā)育健全，需要從母乳中得到保護以抵抗入侵的病菌及病毒。
牛乳鐵蛋白（BLF)是一個(gè)含鐵的糖蛋白，與氧化酶蛋白相反，其在初乳的濃 度很高，幾天后其濃度就迅速下降。BLF也是一個(gè)很廣譜的抗菌蛋白。它可以將 鐵離子從病菌中搶過(guò)來(lái)，從而使病菌失鐵受抑制或死亡。所以BLF對革蘭氏陽(yáng)性 菌如金黃色葡萄球菌，鏈球菌等；革蘭氏陰性菌如大腸桿菌，痢疾桿茵，及志 賀氏桿菌；幽門(mén)螺旋桿菌，流感病毒，濕麥病毒及涎腺病毒都有抑制作用。
由于單純的BLP及BLF都具有生物抗菌蛋白的功能，它們兩種一起的混合物 也應具有抗菌，抗病毒及提高機體免疫力的功能。
已有報導的已實(shí)驗室規模分離出BLF,如用DEAE, S印hadexC50, CMSephaseFF, CMToyopear 1 ， BioradMacro-preCM， Dowx-mac-3以及Pur i 1 i teC115 離子交換樹(shù)脂。但這些方法是將樹(shù)脂裝柱使用并且采用緩沖液。這樣的方法是 不適用大規模的工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐。由于BLF及BLP在牛奶中的濃度很低，要生產(chǎn)出 有商業(yè)經(jīng)濟價(jià)值的，高純度的BLP與BLF必須要釆用極大量的牛奶以提供足夠的 BLF和BLP,比如說(shuō)要日產(chǎn)20公斤純度為96y。以上BLF，假設其總收率為80°/。，原料 牛奶中的BLF是180mg/L。這就需要160噸牛奶。而且這160咱牛奶的處理時(shí)間必 須要在10小時(shí)內完成，因為要考慮到過(guò)長(cháng)的加工時(shí)間不但會(huì )增加牛奶染菌的機 會(huì )，而且要留出時(shí)間給離子交換樹(shù)脂柱再生及衛生消毒以準備第二天的工作。 再者由于牛奶中離子強度約為6-7mS(毫西門(mén)），導致BLF與BLP的吸附動(dòng)力學(xué)很 慢，約需50分鐘才能達到總量的60。/。以上。因此必須要給予樹(shù)脂和牛奶有足夠的 接觸時(shí)間。同時(shí)為了使牛奶中盡可能多的BLP， BLF與樹(shù)脂交換官能團接觸生產(chǎn) 交換反應，必須耍保證一定牛奶流動(dòng)的線(xiàn)速度，這就是說(shuō)，柱中線(xiàn)速度越大，
其樹(shù)脂吸咐動(dòng)力學(xué)就越快。比如說(shuō)柱中的線(xiàn)速度至少要在100cm每小時(shí)以上 (1.6cm每分鐘），對一個(gè)直徑為50cm的園柱來(lái)說(shuō)，要達到l. 6cm每分鐘的線(xiàn)速度， 其體積流量就至少要在3. 2升每分鐘。如果接觸時(shí)間不少于50分鐘的話(huà)，柱的長(cháng) 度要在83cm以上。但是當柱的直徑超過(guò)30cm時(shí)其柱長(cháng)度超過(guò)50cm的話(huà)，就很難 保證其流量及裝柱的質(zhì)量。因而上述這些離子交換樹(shù)脂是為實(shí)驗室規模設計， 都不具備在工業(yè)規模條件下仍保持高流量的性能，因此無(wú)法應用于如此規模的 生產(chǎn)過(guò)程。再者如果在解咐的過(guò)程中釆用緩沖液，還大大的增加生產(chǎn)成本，使 產(chǎn)品無(wú)法竟爭，這更是工業(yè)生產(chǎn)上不可取的。
也有報導釆用超濾膜來(lái)從乳清中分離BLF，但此法生產(chǎn)出的BLF的純度很低， 只有約30%左右。其中的一個(gè)可能的因素就是BLP和BLF的分子量很相近，現階段
的超濾膜技術(shù)是不可能將這兩種蛋白分開(kāi)。
有報導用等電沉淀法來(lái)提取BLF，但由于BLF與BLP的等電點(diǎn)很相近，此法無(wú)
法生產(chǎn)出高純度的BLP及BLF。
有報導使用肝素瓊脂親和色譜來(lái)提取BLF，但此法的生產(chǎn)成本太高，無(wú)法實(shí)
現工業(yè)規模。 發(fā)明內容
為解決現有從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白技術(shù)不能低成本進(jìn)行大工業(yè) 生產(chǎn)的問(wèn)題。本發(fā)明提供一種用攪拌罐同時(shí)從牛奶或乳清水中提取高純度的乳 鐵蛋白、氧化酶蛋白以及乳鐵蛋白和氧化酶蛋白混合物的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白的方法，它采用放置陽(yáng)離子交換樹(shù) 脂的攪拌罐來(lái)吸附、解附、分離提取牛奶或乳清液中的乳鐵蛋白、乳氧化酶蛋 白及其兩者混合物，并輔以膜分離技術(shù)將其分離濃縮和高度純化。
攪拌罐可調攪拌漿轉速為20—100rpm;罐內側壁有增渦流擋板，罐底設置 帶過(guò)濾板的樹(shù)脂床，在樹(shù)脂床上的樹(shù)脂層上方8-12cm高度處設置快速導流抽濾 管。罐內設置供自動(dòng)控制的各種傳感器pH計，重量計，導電率計及溫度計，罐內 液體保溫溫度為3-16 0°C。樹(shù)脂為SPC70樹(shù)脂，樹(shù)脂吸附解附的次數和條件可 以根據不同產(chǎn)品和產(chǎn)品純度的要求設定；樹(shù)脂的吸附時(shí)間為20—180分鐘，吸附 溫度在3-3(TC。樹(shù)脂的吸附時(shí)間為35—60分鐘。樹(shù)脂的解附釆用兩級鹽濃度解 附乳鐵蛋白、乳氧化酶蛋白。第一級鹽濃度為1一2.5%，解附乳氧化酶蛋白，解 附時(shí)間為30-100分鐘；第二級鹽濃度為3. 5—7%,解附乳鐵蛋白，解附時(shí)間為 30-100分鐘；解附乳氧化酶蛋白及乳鐵蛋白混合物的鹽濃度為3-7%解附時(shí)間為 30—IOO分鐘；解附的攪拌速率為20-100rpm。樹(shù)脂解附所用的鹽是鈉鹽、鈣鹽， 鉀鹽；樹(shù)脂在經(jīng)吸附和解附工藝過(guò)程后，無(wú)需再生活化，只要在解附工藝結東 后用反滲透水（RO水）漂洗樹(shù)脂至其離子強度低于l. 6ms即可供下一批次吸附之
用。膜分離技術(shù)使用0.05—0.1微米的微濾膜將乳鐵蛋白，乳氧化酶蛋白的解
附液除菌，去殘余的脂肪與其它小顆粒；用1K一30K分子截流量的超濾膜進(jìn)行脫
鹽和濃縮。高純度的乳鐵蛋白是將經(jīng)上述工藝吸附解附脫鹽濃縮的乳鐵蛋白濃
液再經(jīng)過(guò)一次弱酸型陽(yáng)樹(shù)脂如CM樹(shù)脂的吸附解附和超濾膜的濃縮獲得的。將吸
附、解附、脫鹽濃縮的乳鐵蛋白濃液，乳氧化酶蛋白濃液及其乳鐵蛋白，乳氧 化酶蛋白混合濃液進(jìn)行真空低溫干燥或低溫噴霧干燥成粉混合物。
釆用攪拌罐而不是裝柱的形式來(lái)進(jìn)行吸咐及解咐的過(guò)程。從而不用裝柱及 擔心樹(shù)脂柱短路的問(wèn)題?？梢栽黾訑嚢杷俣纫栽黾游澜飧赖膭?dòng)力學(xué)速度。在 攪拌罐中增加擋板，從而使蛋白的傳遞速度更快。另夕卜點(diǎn)更重要的是，在罐中 樹(shù)脂床表面上安裝-抽濾簡(jiǎn)來(lái)加快排液速度，于便大工業(yè)生產(chǎn)。 附圖說(shuō)明
圖l為本發(fā)明的工藝流程簡(jiǎn)圖 具體實(shí)施方式
1、 采用攪拌罐而不是裝柱的形式來(lái)進(jìn)行吸咐及解咐的過(guò)程。從而不用裝柱 及擔心樹(shù)脂柱短路的問(wèn)題?？梢栽黾訑嚢杷俣纫栽黾游澜飧降膭?dòng)力學(xué)速度。 在攪拌罐中增加擋板，從而使蛋白的傳遞速度更快。另外-點(diǎn)更重要的是，在罐
中樹(shù)脂床表面上（圖1中T2罐中的虛線(xiàn)）安裝-抽濾筒（圖1中T2罐中的FT)來(lái)加快 排液速度。這是因為當吸咐及解咐結東時(shí)，攪拌漿停止攪拌。樹(shù)脂在重力作用 下沉積罐底的過(guò)濾板上（圖1中T2罐中的水平粗黑線(xiàn))形成樹(shù)脂床。這時(shí)如果樹(shù)脂 顆粒太細或太軟就會(huì )造成液體難以通過(guò)樹(shù)脂床，從而造成罐底排液的流量變小， 作業(yè)時(shí)間過(guò)長(cháng)，產(chǎn)率下降。為了加快排液速度，在樹(shù)脂床表面上安裝-抽濾管， 使大部分的液體不經(jīng)樹(shù)脂床而直接經(jīng)抽濾管及閥門(mén)V25， V5， VM1及V6排出。當 罐中的液位降到樹(shù)脂床表面時(shí)，抽濾管FT停止抽液，罐中剩余液體經(jīng)罐底V5， VM1及V6抽出。這樣的過(guò)程就大大改善排液的速度。
2、 本法不需對原料牛奶或乳清水調節pH及離子強度。而利用牛奶或乳清水 的自然pH及離子強度。其正常pH值應為6. 2-6. 9
3、 本文中指的牛奶是指加熱或未加熱消毒的新鮮奶或不新鮮的牛奶以及用 奶粉配制成的牛奶。
4、 此法可直接釆用全脂牛奶及脫脂牛奶?；蛘呤怯媚谭叟渲瞥傻倪€原全脂 或脫脂奶。
5、 此法可直接應用乳清水。
6、 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂均可作為此法的BLF及BLP的吸,樹(shù)脂，但SPC70是為本 法首選吸咐樹(shù)脂。
7、 本文釆用的吸咐時(shí)間20-UO分鐘，吸咐時(shí)間過(guò)短，收率過(guò)低，吸咁時(shí)間 長(cháng)，可提高收率，但?？紤]過(guò)長(cháng)的加工時(shí)間。吸咐及解《#溫度可在3-16度C。8、 采用兩級鹽（氯化鈉）濃度解咁BLP及BLF。第一級鹽濃度為1-2. 5%解咐 BLP,解咐時(shí)間為30-IOO分鐘。第二級鹽濃度為3. 5-7。/。解咐BLF,解咐時(shí)間為
30-100分鐘。
9、 本法解咐中所用的鹽，可以是鈉鹽如氯化鈉等，可以是鈣鹽如氯化鈣等， 也可以是鉀鹽如氯化鉀等。但本文首選氯化鈉。
10、 本法可連續生產(chǎn)，即樹(shù)脂不需另外再生， 一埃解咐結東后，用反滲透 水（R0水）洗樹(shù)脂至其離子強度低于1.6mS即可開(kāi)始下一批的吸咁。
11、 攪拌罐中的攪拌速度在30-70rpm。
12、 采用0.05-0.1微米的微濾膜除菌及殘余的脂肪，微小顆粒等
13、 收集的BLP及BLP的洗脫液（解咐液）用1K-30K分子截留量的超濾膜進(jìn)行
脫鹽及濃縮。
14、 如要生產(chǎn)高純度的BLF,脫鹽并濃縮好BLF再經(jīng)過(guò)一次弱酸型的陽(yáng)樹(shù)脂 如CM樹(shù)脂的吸咐（圖1中的T7罐）以除去其中少量其它雜蛋白。
15、 濃縮后的BLP及BLF的混合液，BLP溶液及BLF溶液可用冷凍干燥法干燥 (圖1中的FD)也可用噴霧干燥（圖1中的SD)。*后蛋白粉包裝（圖l中的方塊箱）。
16、 超濾膜的濾出鹽水可用反滲透裝置(RO)或電滲折裝置回收鹽水，同時(shí) RO濾出水可作生產(chǎn)用水。
圖1中的T1為奶罐或乳清水罐。原料從T1罐輸送到攪拌罐T2后，攪拌60-120 分鐘。吸咐結束后，停止攪拌3分鐘讓樹(shù)脂自由沉降后，再由抽濾菅FT， VM1， V5, V6將吸咐過(guò)的奶液輸送到T3罐。此奶液仍含一定濃度的BLP及BLF，所以仍 可考慮作為牛奶或其它奶制品用。
經(jīng)V3閥門(mén)用RO水淋洗樹(shù)脂（如是全脂或半脂奶，要用34度C的RO水淋洗）3次 以上，以除去殘余的奶液及脂肪。淋洗液經(jīng)閫門(mén)V4排出。
(1) 生產(chǎn)BLP及BLF混合蛋白；
從V2閥門(mén)加入5-6yo鹽水后，撹拌60-IOO分鐘后，停止攪拌3分鐘讓樹(shù)脂自 然沉降，再經(jīng)FT， V25, V5及VM5將解咁液輸送到TMF罐。
經(jīng)O. l微米的微濾膜將解咐液中的微粒及脂肪除掉。微膜濾液再經(jīng)VM2及V8 輸送到T4罐。再從T4罐經(jīng)V18, V15由超濾膜脫鹽并濃縮到蛋白濃度6。/。以上。其 中V13及V8是超濾膜的回流管路，V7是加水閥門(mén)。
BLPF的濃縮液經(jīng)V21輸送到噴霧千燥器干燥或者經(jīng)V20輸送到冷凍干燥器干 燥后得干粉成品。粉未為淡棕綠色。
加RO水經(jīng)V3閥門(mén)淋洗在攪拌罐T2己解咐后的樹(shù)脂直至離子強度低于1.6毫 西門(mén)。淋洗廢液從V4閥門(mén)排出。攪拌罐T2現侍命準備下一輪吸咐。
(2) 生產(chǎn)BLP單體及BLF單體；
第一級鹽水解咁BLP;從V2閥門(mén)加入1.6-2. 5%鹽水（氯化鈉鹽水），攪拌 40-80分鐘，停止攪拌3分鐘開(kāi)始抽濾解咁并經(jīng)V25， V5， VM5輸送到TMF罐，然后 再經(jīng)V2用1. 6-2. 5%鹽水淋洗樹(shù)脂3次，淋洗液經(jīng)V25， V5, VM5排到TMF罐。
第二級鹽水解咐BLF;從V2閥門(mén)向己完成第一級解咐的樹(shù)脂加入4-6。/。鹽水 (氯化鈉鹽水），攪拌60-12G分鐘。
在第二級解咐的同時(shí)，微濾膜單元也同時(shí)對第一級的解咐液進(jìn)行過(guò)濾。濾 液經(jīng)VM2， V10輸送到T5。過(guò)濾結東后，清洗微濾膜單元以準備接受第二級解咐 液。
第二級解咐時(shí)間結東后，將BLF解咐液經(jīng)V25， V5， VM5排入到TMF罐后，由 V3閥加RO水淋洗樹(shù)脂3次以上至離子強度為1.6毫西門(mén)以下。淋洗液合并到TMF 罐。此時(shí)攪拌罐T2巳恢復侍命狀態(tài)淮備下一批生產(chǎn)。
開(kāi)動(dòng)微濾單元過(guò)濾在TMF罐中的BLF解附液。過(guò)濾液經(jīng)VM2， V12輸送到T6罐。
在T5及T6的BLP解咐液及BLF解咁液先后由超濾膜單元脫鹽濃縮。然后BLP 經(jīng)V17輸送到干燥單元。干燥后的粉未為棕綠色。
對要生產(chǎn)高純度的BLF則耍經(jīng)過(guò)在T7罐中的陽(yáng)離子樹(shù)脂除去殘余不純的奶 蛋白。BLF的脫鹽溶液經(jīng)V16， V23輸送到T7罐，撹拌吸咐20-50分鐘后，抽濾液 經(jīng)V24輸送到干燥單元進(jìn)行干燥。干燥后粉未為淡粉紅色。
實(shí)施例一：半脫脂牛奶993升，溫度8.2度C, pH6. 6，總蛋白為32. 5克每升， BLP濃度366亳克每升，BLF濃度為138毫升每升。采用圖l的工藝路線(xiàn)，并按說(shuō)明 所描述的步驟生產(chǎn)BLP與BLF的混合蛋白粉。攪拌罐T2內裝SPEC70樹(shù)脂。吸咐時(shí) 間115分鐘。解咐時(shí)加入5.5%氯化鈉鹽水90升，解咐時(shí)間65分鐘。解咐及淋洗液 合并到微濾單元（O. l微米微濾膜）進(jìn)行微濾除菌除脂肪。濾液136升輸送到超濾 膜單元（3QK分子截止量)進(jìn)行脫鹽濃縮。收得濃縮液Q.52升。釆用冷凍干燥方法 得淡棕綠色干粉351克，含水4. 3%，總蛋白為93. 2%,灰分2. 6%。
實(shí)施例二：脫脂牛奶996升，pH6. 7,溫度6. 6度C總蛋白為32. 9克每升，BLP 濃度為378毫克每升，BLF濃度為129毫克每升。采用圖l的工藝路線(xiàn)，并按說(shuō)明 中所描述的步驟生產(chǎn)單體的BLP蛋白及單體的BLF蛋白。加入內裝有SPEC70樹(shù)脂 攪拌罐吸咐115分鐘，攪拌速度為60rpm。收集己吸咁過(guò)的牛奶后，用RO水淋洗 樹(shù)脂。加入第一級鹽水（2.4W90升解咐36分鐘，攪拌速度30rpm。收集第一級BLP 解咐液并加2. 3%鹽水淋洗樹(shù)脂3次。合并淋洗液到BLP解咐液中后用微濾膜除菌 及脂肪。
在BLP微濾同時(shí)，加入86升4.W鹽水于攪拌罐中進(jìn)行BLF解咐，攪拌速度 36rpm。解咐時(shí)間60分鐘。收集解咐液后用RO水淋洗樹(shù)脂。合并淋洗液到解咐液 中共得151升。輸送到微濾單元進(jìn)行除菌及除脂肪。濾液輸送到超濾單元（30K 分子截止量）并加水進(jìn)行脫鹽（洗到離子強度低于l. 6毫西門(mén)）濃縮至1%蛋白濃度
分子截止量）并加水進(jìn)行脫鹽（洗到離子強度低于l. 6毫西門(mén)）濃縮至1%蛋白濃度
時(shí)（7.6升），輸送到CM樹(shù)脂罐除去雜蛋白。然后繼續用超濾膜濃縮到O. 39升后送 至冷凍干燥單元干燥得淡粉紅色粉未80.5克。粉未含水3.1%,灰份1.1%,總蛋 白為96. 5%。
微濾后的BLP輸送超濾單元加水脫鹽（洗到離子強度低于1.6毫西門(mén)）后， 繼續濃縮。收集BLP濃縮液0.73升。用冷凍干燥法干燥得棕綠色粉未351克， 粉未含水4. 2%,灰份2. 1%,總蛋白為94. 1%。